Если модифицируете готовый гиф - В image/mode переставьте галочку с indexed colors на RGB. В окошке layers щелкните два раза на слой Background. Сотрите «лишние» части картинки. Сохраните - file/save for web, при сохранении не забудте поставить галочку напротив Transparency, выберите нужный метод задания прозрачности.

Если сохраняете файл Photoshop - «склейте» слои: layer/flatten image, далее точно так же.